當(dāng)PCR結(jié)果不甚滿意時,首先檢查以下幾方面并遵照執(zhí)行:

1、將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。

2、當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃"熱啟動"開始循環(huán)時,切記在加入酶后稍微振蕩一下,因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。

3、不要隨意減少dNTP的用量,它是一個系統(tǒng)的因素,必須與其它成份保持平衡。

4、對于有問題的PCR反應(yīng),例如模板的量少,模板不純和環(huán)狀模板等,先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性,后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。

5、沒有擴(kuò)增產(chǎn)物:在提供MgCl2緩沖液中,以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。泳道中出現(xiàn)模糊條帶,如果DNA模板中存在RNA,則按上述提示濃度補加MgCl2,因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。

6、檢查退火溫度和變性條件,如果有需要的話,可降低退火溫度。

7、檢查模板和引物的用量。

8、增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。

9、泳道中出現(xiàn)模糊條帶:減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。

10、提高退火溫度,但不要超過68℃。

11、重新設(shè)計引物或設(shè)計更長的引物。



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